一、前言
以病毒为载体的预防用活疫苗是指将外源目的基因片段构建在病毒载体中，重组后的病毒载体导入机体后可表达目的蛋白，目的蛋白通过刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防某种疾病的目的。该指导原则适用于以病毒为载体的预防用活疫苗制品。其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体的申报内容。其基本原则是：安全有效，质量可控，同时应鼓励创新，促进以病毒为载体疫苗的研究。对一些新的技术路线要建立相应的质控要求，可有一定的灵活性，应注意到以病毒为载体活疫苗只是处于研究的初级阶段，而且与常规生物制品相比有其本身的特点，需要不断的积累经验。为此，申请者应加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制订标准操作规程及质控标准，并予严格实施。
二、疫苗构建的基本要求
(一)国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果
1．应了解所预防或治疗疾病的流行情况、疾病的危害程度等；包括国内及国外对该类疾病的预防和治疗手段。
2．应了解国内外同类产品研究和开发等情况，其中包括所用的DNA载体、目的基因片段、生产工艺、临床前试验和临床试验的结果及进展，以及该类产品所面临的主要问题。
3．对研制该类DNA制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析。
4．应对该方案与国外内已批准的或正在进行的方案的不同之处、特点及其优越性等进行分析。凡属新的方案，应提供其优越性及安全性的依据。
5．利益风险比。根据该预防方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡的进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。
(二)病毒载体及宿主细胞的有关内容
1．目前所用的病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及痘苗病毒载体等。为此，应明确病毒载体的来源、结构，并进行必要的专利查询，其中包括载体DNA的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子以及PolyA位点等，应提供详细资料。若改变结构(如丢失片段或插入片段)，须对相应片段进行测序分析。若属新的或改变结构的病毒载体，须对组建的材料、方法、组建步骤及鉴定进行详细的研究。
2．生产用细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形
态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须明确来源、分离的方法步骤等。
(三)目的基因
1．明确目的基因来源的病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、基因型和亚型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。
2．对目的基因的序列、大小、来源以及表达产物的预计大小进行分析；明确目的基因选择的依据以及其表达蛋白在防中的作用。
3．若对目的基因进行了修饰，应对其修饰后的基因序列以及修饰后基因与人类已知基因序列的同源性进行分析。若在表达的目的重组蛋白以外有其它氨基酸寡肽同时表达时，应对寡肽的作用和选择的依据进行分析。并对基因修饰或重组的利弊权衡进行分析。
(四)重组病毒的构建及种子细胞库的建立
1．应对穿梭质粒与目的基因连接的详细步骤进行研究，并对构建以后的重组穿梭质粒进行检定和确证。对重组穿梭质粒的转化、扩增和纯化条件进行研究。
2．对目的基因片段导入病毒的过程进行研究，建立切实可行的筛选和确证的方法。对含有目的基因片段的重组病毒的特征进行分析。
3．对重组病毒的特性进行检定，必要时进行序列分析，研究必要的控制元件和选择标记基因有无变异以及对插入的目的基因序列进行分析，检查有无变异。
4．应当对重组病毒感染细胞条件进行优化。对重组病毒的浓度、含量等进行分析。对重组的保存条件以及稳定性进行研究。应当建立重组病毒库。应对重组病毒库的外源因子进行分析。
5．产病毒的种子细胞库的组建：由病毒载体转染包装细胞或非包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即原始种子细胞库。该原始种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。其中应当包括细胞形态学、染色体组型、传代次数、稳定性、病毒滴度的检测、病毒介导目的基因的表达活性以及外源因子的检查等。
6．复制型病毒的检测：包括方法、技术可靠性及结果
(五)对表达产物的分析
1．将重组病毒感染合适的哺乳动物细胞，对感染条件进行优化。
2．建立对表达产物的分析方法，包括表达产物的大小、特征等。
3．建立对表达产物的免疫学反应的特征进行分析的方法。
三、生产工艺
(一)工作细胞库的建立及质控：须明确工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数(保持同样的病毒滴度及转导基因的活性)及工作细胞库的规模、保存条件。并对以下内容进行研究：
1．细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基因的存在状态及其表达。
2．病毒滴度
3．转导基因的活性
4．外源因子的检测结果
5．复制病毒的检测
所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检定或由国家药品监督管理局指定的单位检定。
(二)种子细胞培养方法和扩增的步骤进行优化，建立培养过程中的质控指标。
(三)对重组病毒的分离、富集及纯化的工艺进行优化，并建立相应的质控指标。
(四)对原液的稀释分装的工艺进行优化，并建立质控指标。
(五)添加物的质控：在细胞培养、制备过程中使用血清、生长因子、抗菌素等时，应对去除该类添加物的过程及效果进行研究。并应对保存液成份应进行安全性研究。
四、制品的药理、毒理学研究
(一)安全性试验
1．复制型病毒的检测，应严格检查复制型病毒并制定相应的标准。
2．特种添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，如使用明胶、缝线或金属粒子等其它添加物，应对此类物质进行动物安全性研究。
3．分子遗传学的评估：应对目的基因在体内的存在状态以及分布情况进行研究。
4．目前用于载体的病毒有疫苗株和非疫苗株，对非疫苗株应进行严格的安全性研究。
(二)毒理反应的评估
这也是安全性试验的重要组成部分。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性(最大耐受量)及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量(按体重或表面积计算)外，尚需有一个较大的剂量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外，应包括其它相关的检测指标。还应对局部刺激进行研究。
(三)免疫学的评估
应注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应等。应对这些问题进行研究并提出相应的监控及处理措施。
五、质量控制及检定的要求
(一)生产过程中质量监控标准的建立及要求
在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各申报者所选择的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。
(二)产品的质量检定与要求
1．外观检查：根据样品的特征建立外观检查的质量标准。
2．pH值检测，可根据一般生物制品的要求建立标准，一般为7．2±0．5。
3．鉴别实验，主要包括对病毒载体的鉴别和对表达产物的鉴别试验，对病毒载体的鉴别主要通过免疫学方法检测病毒蛋白、检测病毒核酸的大小或限制性内切酶对重组病毒的核酸进行酶切分析。对表达产物的分析主要用免疫反应检测基因表达产物和用PCR方法检测插入基因。
4．建立适当的方法对病毒的滴度及含量进行检测。
5．体外效力实验：检测其体外表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，并对该检测方法的敏感性以及定量的准确性进行验证；还应检测表达抗原的图谱，其各表达目的抗原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。
6．建立适当的方法检测复制型病毒，并制定相应的质控标准。
7．无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。
8．热原试验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，并制定相应的质控标准。
9．异常毒性实验：主要用小鼠和豚鼠进行试验，一般小鼠腹腔接种一个人用剂量，豚鼠接种5个人用剂量。该试验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品与一般生物制品相比又有其特殊性，应根据病毒的特征建立不同的病毒特异性毒性反应，如可将以痘苗病毒为载体的制剂接种在兔背皮下观察肪性反应。
10．属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5%。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达到每批中1%。检测方法，须用S+/L-法、标记挽救法或RT/PCR中的两种方法。必须用阳性对照(COS4070A上清液)及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射同位素杂交或同样敏感的系统。
11．若最终制品为腺病毒，须补充以下资料：
(1)腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组DNA定量为依据，以1个OD260单位作为1．11012颗粒；同时要测定感染滴度。
(2)复制型腺病毒的检测：参考美国FDA1996的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病毒不超过1个PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制型腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率(MOI)在10～100之间(过高MOI可抑制复制型病毒的生长)。
12．对残余宿主细胞的蛋白进行检测并建立质控标准。
13．生物效价：应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的方法，并对该方法进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法(如特异性CTL反应的方法或Elispot方法等)，也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。
若已有蛋白类疫苗，其评价方法应参照有关蛋白类疫苗的评价方法。
若有动物模型，可进行动物保护性实验。
14．佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组DNA制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该类物质的量以及与重组DNA结合率的方法，并制定质量标准。
15．添加物的质控：添加物指细胞培养、制备过程中所用的血清、生长因子等。应建立检测添加物的方法和质控标准。
六、临床研究用样品要求
(一)对申请I期临床试验的申报者，应在GMP条件下至少生产一批产品，其每批产量一般不少于1000人份。
(二)产品必须由中国药品生物制品检定所进行质量复核。
(三)完成每期临床研究后需及时总结材料并报国家药品监督管理局申请后续的临床试验。若效果明确，可以进行III期临床试验。申报者应当在GMP和正常规模化生产的条件下，并由中国药品生物制品检定所或国家药品管理局确定的药品检验机构进行质量复核。
预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则(略)
艾滋病疫苗临床研究技术指导原则
一、前言
艾滋病的流行对人类健康和社会发展产生了严重危害，迫切需要采取有效的预防和控制措施。艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。对HIV致病机理的研究证实有时人体能够取得对HIV的自然免疫，发展安全有效的艾滋病疫苗在理论上是可行的。
艾滋病疫苗研究的目标是发展一种能够预防HIV感染的方法。但是艾滋病免疫保护的机理十分复杂，很难完全预防HIV感染并清除病毒，因此正确认识和评价疫苗的作用是十分重要的。能够限制病毒的复制、减少HIV传播的艾滋病疫苗对于控制艾滋病的流行也是有效的。更现实的艾滋病疫苗的研究目标是降低病毒血症、保持低病毒载量水平、减缓HIV疾病的进程，降低病毒在人群中的传播率。
临床试验是确定疫苗安全性和有效性的决定性方法，艾滋病疫苗必须通过科学设计的三个阶段临床试验的检验，考察其安全性、以及能否达到预期的目标。为了确保艾滋病疫苗临床研究的准确性，必须有科学、周密的设计和严格的管理。
二、艾滋病疫苗临床试验的基本原则
(一)符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，研究对象的权利、安全和意志高于研究的需要。
(二)为研究对象保密，尊重个人隐私。防止研究对象因接种艾滋病疫苗而受到歧视。
(三)临床前研究的结果支持进行临床研究。
(四)符合GCP要求。
三、艾滋病疫苗临床试验的方法和步骤
(一)临床试验的前提和条件
1．具备相关的实验室技术和条件，建立和完善检测HIV感染和免疫学指标的方法，建立区分疫苗诱导的抗体与野病毒感染产生的抗体的方法。
2．掌握多中心研究的现场，具有HIV感染高危人群队列研究的基础。
3．具有适合进行临床试验的疫苗：试验用疫苗和安慰剂必须是适合进行临床研究的产品，在GMP条件下生产，通过国家检定。疫苗和安慰剂的外观应完全相同。
(二)研究对象的招募和筛选
1．研究对象
Ⅰ期试验招募HIV阴性的健康志愿者。Ⅱ/Ⅲ期试验招募HIV阴性的高危人群，包括HIV感染者的性伴或静注毒品者。也可以招募和随机分配整个HIV感染高危险性社区人群。男性或女性均可，年龄18-60岁。
2．知情同意
是一个精神健全的个体在获取必要的信息后，做出的是否参与研究的决定。研究对象要能够充分理解项目内容，并在没有受到强迫和诱导的情况下自愿做出决定。研究者在项目开始前要向研究对象充分讲解项目的内容，在研究进行的过程中也要不断向研究对象介绍研究进展情况、出现的问题和解决的办法。要用研究对象熟悉和易懂的语言解释研究的目的、方法、步骤和可能出现的危害，请他们自愿决定是否参加研究，并申明在研究的过程中他们随时可以退出，无任何不良影响。要向研究对象提供一份知情同意文件，请他们自己决定是否签署文件。
3．体格检查
首先进行健康问卷调查，请研究对象提供详细的病史，包括性活动和药物使用史。然后进行体检，包括血、尿常规检查、胸部X线检查。女性需进行妊娠实验，阴性才能参加研究。所有研究对象自研究开始直至免疫结束后的3个月内性交时必须使用屏障方法避孕。
4．行为咨询
对研究对象进行规范的HIV感染的危险性评估和行为咨询，防止由于接种疫苗导致危险行为增加。
(三)Ⅰ期试验
＊目的：检验疫苗的安全性、检验机体是否有免疫应答。
＊实验人数：20-30名HIV阴性的健康志愿者。
＊方法：
第一次接种和每次加强接种均需将研究对象收入艾滋病疫苗临床基地医院中观察，直至接种以后3天。
为所有研究对象接种试验疫苗，按照预定的接种程序从最小剂量起，在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。
＊观察时间：最后一次接种完成后6个月。
＊观察指标：
1．毒副反应：自接种之日起至接种完成以后28天，请研究对象每天填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第7天、14天、28天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部X线检查。
2．HIV感染的指标：HIV抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行HIVRNA测定。
3．免疫应答：HIV保护性抗体测定(中和抗体或粘膜IgA)、HIV特异性细胞免疫测定。
(四)Ⅱ期试验(第一阶段)
＊目的：在I期试验的基础上进一步检查疫苗的安全性，观察疫苗能否刺激机体特异性免疫应答，评估疫苗的安全性和生物活性，确定理想的接种剂量和程序。
＊实验人数：300名以上HIV阴性的高危人群。
方法：按照预定的接种剂量和接种程序将研究对象分组，为他们接种疫苗。在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。
＊观察时间：最后一次接种以后1年。
＊观察指标：
1．毒副反应：自接种之日起至接种完成以后28天，请研究对象每天填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第7天、14天、28天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部X线检查。
2．HIV感染的指标：HIV抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行HIVRNA测定。
3．免疫应答：HIV保护性抗体测定(中和抗体或粘膜IgA)、HIV特异性细胞免疫测定。
(五)Ⅱ期试验(第二阶段)
＊目的：在第一阶段试验的基础上进一步检验疫苗的安全性和特异性免疫应答，初步考察有效性。确定理想的接种剂量和程序。
＊实验人数：200名HIV阴性的高危人群。
＊方法：随机、双盲对照。两组的人数应该相等或接近。按照预定的接种剂量和程序，在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。
＊观察时间：最后一次疫苗接种以后2年。
＊观察指标：
1．毒副反应：自接种之日起至接种完成以后28天，请研究对象每天填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第7天、14天、28天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部X线检查。
2．HIV感染的指标：HIV抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行HIVRNA测定。
3．免疫应答：HIV保护性抗体测定(中和抗体或粘膜IgA)、HIV特异性细胞免疫测定。
4．HIV感染者病毒载量和CD4+T细胞计数测定。
5．HIV感染危险行为的监测。
6．HIV感染者的性伴和新生儿HIV感染的监测。
(六)Ⅲ期试验
＊目的：确定疫苗的安全性和有效性。
＊实验人数：3000名以上HIV阴性的高危人群。样本大小取决于发病率、估计的疫苗有效率和统计学显著性。
＊方法：随机、双盲对照。两组的人数应该相等或接近。用根据Ⅰ/Ⅱ期试验得出的免疫方案进行接种。
＊观察时间：最后一次疫苗接种后至少3年。
＊观察和监测指标：
1．毒副反应：接种后28天内请研究对象每天填写健康记录卡，以后每周填写一次，有不良反应随时与研究人员联系。每6个月进行一次体检，进行血、尿常规检查和胸部X线检查。
2．HIV感染的指标：HIV抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行HIVRNA测定。
3．免疫效果：HIV保护性抗体测定(中和抗体或粘膜IgA)、HIV特异性细胞免疫测定。
4．HIV感染者病毒载量和CD4+T细胞计数测定。
5．HIV感染危险行为的监测。
6．HIV感染者的性伴和新生儿HIV感染的监测。
＊统计学有效水平：证实疫苗减少了HIV感染的水平至少要达到30%统计学显著性，也就是如果临床试验被重复，应该在100次试验中有95次观察到30%以上的效果。为了达到具有统计学意义的30%有效性，必须观察到接种疫苗组与对照组相比，感染率下降45-65%或更高，取决于影响临床试验统计学显著性的一些因素，包括纳入的志愿者的数量、对照组的感染率、临床试验观察的时间等等。
四、艾滋病疫苗临床试验的替代终点
对于多数传染病来说，有效的疫苗应能够预防疾病的发生、并使宿主清除感染性病原体。艾滋病是一种持续性感染而不是急性自限性疾病，临床终点如果是证实没有疾病就需要观察很多年(10-20年)。有必要建立和使用替代终点指标以加快疫苗效果的验证，以便能够用最快捷的方法评估候选疫苗的有效性，艾滋病疫苗临床试验短期内可能观察到以下三种结果：接种疫苗组的HIV感染率显著下降、接种疫苗组的HIV感染率没有显著下降，但是接种后感染者的疾病进程显著减缓、接种疫苗组的HIV感染率和感染者的疾病进程与对照组相比均没有显著变化。尽管预防HIV感染是最希望看到的结果，但是有些疫苗可能仅仅对减缓HIV疾病的进程或减少HIV的传播有好处。因此可以在评估HIV疾病进程的基础上建立替代终点指标。
(一)病毒学终点
1．降低病毒载量的定点(setpoint)大于1个logRNAcopies/ml。
2．降低血浆病毒载量到有生物学意义的定点以下(103RNAcp/ml)，同时延长作用有意义的时间(大于1年)。
(二)免疫学终点
1．保持CD4细胞计数大于350个细胞/靗，或
2．减少CD4细胞下降的速率。
(三)临床终点
1．减少了接种人群中需要进行抗病毒治疗的HIV感染者的数量。
2．延长了从HIV感染到需要进行抗病毒治疗的时间间隔。注意在试验进行期间抗病毒治疗标准的改变可能干扰临床终点的评价和解释。
(四)流行病学终点
1．降低了接种疫苗者感染HIV后的性传播率。
2．降低了接种疫苗者感染HIV后的母婴传播率。
艾滋病疫苗临床试验应该特别注意测定这些接种后的替代指标，以检验疫苗的有效性及其有效的机制。可以假设疫苗可能对发生HIV感染有中度效果和/或对替代终点有中度效果，在这个基础上设计Ⅲ期临床试验。如果一个疫苗使HIV感染发生率的95%可信限降低30%或降低了病毒载量的定点(1-2个RNAcopies/ml)可以认为是有效的。
五、艾滋病疫苗临床试验的实施和管理
艾滋病疫苗的临床试验是一项十分艰巨复杂的工作，为了确保研究的准确性，必须有科学、周密的设计和严格的管理，必须经国家药品监督管理部门批准。项目管理机构、研究者和伦理审查委员会三方应密切配合才能保证研究的科学性、准确性并符合伦理学要求。
(一)伦理审查委员会(IRB)
独立于研究小组，至少由5人组成，包括医学统计学家、律师、临床医生、科学家、社区工作人员等。该委员会不能直接从疫苗研究中获得任何经济和物质上的好处。伦理审查委员会的职责是对项目进行伦理审查，保护研究对象的人权、安全和健康，给弱势人群特别的关注，同时也要考虑项目的科学性。在项目实施之前审查研究方案，在项目的实施过程中要对其进行不间断的检查，包括对研究进展进行监督。
(二)项目管理机构(sponsor)
是负责发起、管理和资助疫苗临床研究的个人、公司或机构。职责是：
1．择研究者，对其资格和能力进行考察并与其签订研究协议。
2．审查研究方案。
3．向研究者提供试验疫苗，确保试验疫苗在GMP条件下生产并在合适的条件下储存、运输和使用。对试验疫苗进行安全性评价。
4．建立独立的监督委员会(Independent Data Monitoring Committee IDMC)，负责评价临床试验的进展、安全资料、有效性终点、向管理机构提出继续、更改或停止临床研究的建议。
5．实施质量保证和质量控制计划，确保研究按照设计方案、GCP要求和相关规定进行。
6．指定医学专家回答和解决实验相关的医学问题。
7．指定合适的人选负责所有阶段试验的设计、分析以及最终结果的报告。
(三)研究者(Investigator)
是负责制定和执行临床研究方案的人。对研究者要求包括：
1．教育、培训和研究经历证明其能够胜任疫苗的临床研究，要将证明个人能力的简历和其他相关文件提供给伦理审查委员会(IRB)。
2．熟悉所研究的疫苗。
3．熟悉GCP的要求并保证遵守。
4．接受伦理审查委员会和项目管理机构的监督。
5．保证研究的可行性并具有充分的工作基础：包括能够在特定的时间内招募到足够的研究对象、有足够的实验室检测和研究能力，有多中心研究的现场并与其有良好的协作关系，有充足的进行研究的时间等。
六、艾滋病疫苗临床研究基地
艾滋病疫苗的临床试验是大样本队列研究，需要对HIV感染的高危人群进行长期随访，也要求相关实验室的密切配合，实施的难度很大。艾滋病疫苗的临床试验属于探索性研究，其安全性和有效性具有很多不确定性，需要对研究对象进行密切观察和准确检测。为了使艾滋病疫苗的临床试验能够顺利实施并具有科学性和可靠性，需要设立专门的艾滋病疫苗临床研究基地并加以严格管理。
艾滋病疫苗临床基地应具备下列条件：
(一)得到国家有关管理部门的批准，遵守GCP规则。最好有疫苗临床试验的基础和国际合作的经验。
(二)具有能够承担疫苗安全性和有效性评价任务、达到GLP标准的实验室，具备相关的设备和实验技术人员。检测的项目包括：HIV抗体初筛和确认、外周血淋巴细胞分离和保存、病毒载量测定和CD4/CD8细胞计数、HIV特异性细胞免疫检测。
(三)建立安全监测系统，对接种疫苗产生的不良反应进行监测，有能够接收受试者并对其进行诊治的医院和医生，备有应急药物和设备。对出现的不良反应及时进行救治并按规定向有关部门报告。
(四)具备一定的数据统计和分析能力，有专职数据资料管理人员。
(五)建立社区咨询委员会(Community Advisory Board)，能够代表社区不同人群的利益和观点，对疫苗是否合适提出建设性意见，并促进社区对艾滋病疫苗临床试验的接受。
(六)建立受试人群队列：在临床试验开始前数年就应着手建立高危人群队列，每年至少随访2次，随访率大于90%。该队列每年的HIV新感染率最好大于5%。
人用重组DNA制品质量控制技术指导原则
一、引言
由于分子遗传学、核酸化学及重组DNA(rDNA)技术的迅速发展，现已能够确定和获得许多天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体或引入某种宿主细胞后，能有效地表达该基因产物，再经分离、纯化和检定，可得到用于预防和治疗某些人类疾病的制品，诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、干扰素等。
用不同于常规方法的rDNA技术生产的制品，是近年来出现的新产品，评价其安全性和有效性亦不同于常规方法。这一领域中的知识和技术还在不断发展，为了有利于这类制品在我国的研究和发展，并为这类制品的审评提供依据，有必要制定一个原则性指导文件，以保证在人群中试验或应用时安全有效。
本“人用重组DNA制品质量控制技术指导原则”(以下简称《指导原则》)不可能面面俱到，可能有许多专门技术问题会出现，对于这类问题或某一特定制品，则应视具体问题具体研究决定。本《指导原则》亦将随科学技术发展和经验积累而逐步完善。
二、总则
(一)本《指导原则》适用于rDNA技术生产并在人体内应用的蛋白质、肽类制品。
(二)凡属与一般生物制品有关的质量控制，均按现行版《中国药典》有关规定执行。有关生产设施的要求应参照国家药品监督管理局《药品生产质量管理规范》执行。
三、质量控制要求
(一)原材料的控制
1．表达载体和宿主细胞
应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。应说明载体组成各部分的来源和功能，如复制子和启动子来源，或抗生素抗性标志物。提供至少包括构建中所用位点的酶切图谱。应提供宿主细胞的资料，包括细胞株(系)名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。
应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态(是否整合到染色体内)及拷贝数。应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。
2．克隆基因的序列
应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。
3．表达
应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。
4．原辅料
原辅料应按照国家药品监督管理局有关规定执行。动物源性原料的使用应提供来源及质控检测资料；
(二)生产的控制
1．主细胞库(MASTERCELLBANK)
rDNA制品的生产应采用种子批(SEEDLOT)系统。从已建立的主细胞库中，再进一步建立生产细胞库(WCB)。
含表达载体的宿主细胞应经过克隆而建立主细胞库。在此过程中，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同细胞(菌种)；一个工作人员亦不得同时操作两种不同细胞或菌种。
应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新作全面检定。
真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致癌性应有详细报告。如采用微生物培养物为种子，则应叙述其特异表型特征。
一般情况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终产品的特征鉴定应特别注意。
种子批不应含有外源致癌因子，不应含有感染性外源因子，如细菌、支原体、真菌及病毒。
有些细胞株含有某些内源病毒，例如逆转录病毒，且不易除去。但当已确知在原始细胞库或载体部分中污染此类特定内源因子时，则应能证明在生产纯化过程可使之灭活或清除。
2．有限代次生产
用于培养和诱导基因产物的材料和方法应有详细资料。对培养过程及收获时，应有敏感的检测措施控制微生物污染。
应提供培养生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确立废弃一批培养物的指标。根据宿主细胞／载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，并应提供最适培养条件的详细资料。
在生产周期结束时，应监测宿主细胞／载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般情况下，用来自一个原始细胞库的全量培养物进行监测，必要时应做一次目的基因的核苷酸序列分析。
3．连续培养生产
基本要求同2项。
应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。对可以进行后处理及应废弃的培养物，应确定指标。从培养开始至收获，应有敏感的检查微生物污染的措施。
根据宿主／载体稳定性及表达产物的恒定性资料，应规定连续培养的时间。如属长时间连续培养，应根据宿主／载体稳定性及产物特性的资料，在不同间隔时间作全面检定。
4．纯化
对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。
如采用亲和层析技术，例如用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。
对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。
关于纯度的要求可视制品的用途和用法而确定，例如，仅使用一次或需反复多次使用；用于健康人群或用于重症患者；对纯度可有不同程度要求。
(三)最终产品的控制
应建立有关产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法。检测的必要性和纯度要求取决于多种因素：产品性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验。一般说来下列试验对控制产品质量是可以采用的。新的分析技术及对现有技术的改进正在不断进行，适当时应使用这些新的技术。
1．物理化学鉴定
(1)氨基酸组成
使用各种水解法和分析手段测定氨基酸的组成，并与目的蛋白基因序列推导的氨基酸组成或天然异构体比较。如需要时应考虑分子量的大小。多数情况下，氨基酸组成分析对肽段和小蛋白可提供有价值的结构资料，但对大蛋白一般意义较小。在多数情况下，氨基酸定量分析数据可用于确定蛋白含量。
(2)氨基酸末端序列
氨基酸末端分析用于鉴别N-端和C-端氨基酸的性质和同质性。若发现目的产品的末端氨基酸发生改变时，应使用适当的分析手段判定变异体的相应变异数量。应将这些氨基酸末端序列与来自目的产品基因序列推导的氨基酸末端序列进行比较。
(3)肽谱
应用合适的酶或化学试剂使所选的产品片段产生不连续多肽，应用HPLC或其他适当的方法分析该多肽片段。应尽量应用氨基酸组成分析技术，N-末端测序或质谱法鉴别多肽片段。对批签发来说，经验证的肽谱分析经常是确证目的产品结构/鉴别的适当方法。
(4)巯基和二硫键
如果依据目的产品基因序列存在半胱氨酸残基时，应尽可能确定巯基和/或二硫键的数量和位置。使用方法包括肽谱分析(还原和非还原条件下)、质谱测定法或其他适当的方法。
(5)碳水化合物结构
应测定糖蛋白中碳水化合物含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。此外尽可能分析碳水化合物的结构、寡糖形态(长链状)和多肽的糖基化位点。
(6)分子量
应用分子筛层析法、SDS-PAGE(还原和/或非还原条件下)、质谱测定法、和/或其他适当技术测定分子量。
(7)等电点
通过等电聚焦电泳或其他适当的方法测定。
(8)消光系数(或克分子吸光度)
多数情况下，可取目的产品于UV/可见光波长处测定消光系数(或克分子吸光度)。消光系数的测定为使用UV/可见光或分光光度计检测已知蛋白含量的溶液，蛋白含量应用氨基酸组成分析技术或定氮法等方法测定。
(9)电泳图型
应用PAGE电泳、等电聚焦、SDS－PAGE电泳、免疫印迹、毛细管电泳法或其他适当的方法，获得目的产品/药物的一致性，同一性和纯度的电泳图谱和数据。
(10)液相层析图谱
应用分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析或其他适当方法，获得目的产品/药物的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据。
(11)光谱分析
适当时，应用紫外或可见光吸收光谱法测定，使用圆二色谱、核磁共振(NMR)、或其他适当的方法检测制品的高级结构。
2．杂质检测
(1)工艺相关杂质
工艺相关杂质来源于生产工艺，可分三大类：来源于细胞基质、培养基和下游工艺。
①来源于细胞基质的杂质包括源于宿主生物体的蛋白/多肽；核酸(宿主细胞/载体/总DNA)；多糖及病毒。对于宿主细胞蛋白，一般应用能检测出较宽范围蛋白杂质的灵敏的免疫检测方法。应用不含目的基因的生物体粗提物，即不含产品编码基因的生产用细胞，制备上述试验使用的多克隆抗体。可通过对产品的直接分析方法(如杂交技术法)检测宿主细胞的DNA水平，和/或通过标记实验(实验室规模)检测证实通过纯化工艺能去除核酸。对于有意导入的病毒，应验证生产工艺中去除/灭活病毒的能力。
②来源于培养基的杂质包括诱导剂(多核苷酸，病毒)、抗生素、血清及其他培养基组分。
③来源于下游工艺产生的杂质包括酶、化学/生化处理试剂(如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(如重金属、砷、非有色金属离子)、溶剂、载体/配体(如单克隆抗体)，及其他可滤过的物质。
(2)产品相关杂质
以下为最常见的目的产品的分子变异体，并列出了相应的检测方法：
①化学修饰类型：应考虑脱酰胺、异构化、错配S-S连接和氧化形式的分离和鉴别。对这些变异体的分离和鉴别，可应用层析法和/或电泳法(如HPLC、毛细管电泳、质谱法、圆二色谱)。
②降解物和聚合体：聚合体包括二聚体和多聚体：可用分子筛层析法(如SE-HPLC)进行定量；降解物：应建立降解物的判定标准，并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。
3．生物学测定
(1)鉴别试验
应用免疫印迹法，或者在可能情况下，应用参考品将rDNA制品与天然产品通过生物学比较试验，确定其与天然产品是一致的。
(2)效价测定
采用国际或国家参考品，或经过国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。
(3)特异比活性测定
在测定生物学活性的基础上，对有些制品还应用适当方法测定主药蛋白含量，测定其特异比活性，以活性单位／重量表示。
(4)热原质试验
应采用家兔法或鲎试验法(LAL)作热原质检测，控制标准可参照天然制品的要求。
(5)无菌试验
参照现行版《中国药典》有关规定进行，应证实最终制品无细菌污染。
(6)抗原性物质检查
必要时，如制品属大剂量反复使用者，应测定最终制品中可能存在的抗原性物质，如宿主细胞、亚细胞组分及培养基成份等。患者反复接受大剂量的这类制品时，应密切监测由这些抗原可能产生的抗体或变态反应。
(7)异常毒性试验
可参照现行版《中国药典》有关规定进行。
4．其他
根据产品剂型，应有外观(如固体、液体、色泽、澄明度等方面的描述)、水分、PH值、装量等方面的规定，可参照现行版《中国药典》相关规定执行。
四、临床前安全性评价
临床前安全性试验的目的主要是确定新制品是否会在人体引起未能预料的不良反应。但是，用于一般化学药物的传统安全性或毒性试验对rDNA产品不一定适用，用传统毒性试验来评价rDNA产品往往有困难，并受多种因素的影响。例如，某些蛋白质，如干扰素，具有高度种属特异性，这种人的蛋白质对人的药理学活性远高于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基就不一样。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。
另外，由于产品效价、生产工艺或者产品稳定性等要求，对产品进行修饰或者改构，应提供与未修饰或者改构产品比较的研究资料。以简化生产工艺为目的在产品中引入的额外多肽片段如His-tag，在最终产品中应尽可能去除。
综上所述，对rDNA产品的临床前安全性试验要求，难以一概而论，应采取较为灵活的处置方法。除了一般生物制品的毒性试验要求之外，其它如长期毒性试验、药代动力学试验、药理学试验、毒理学试验，以及致畸和致突变等试验，应根据制品性质，与国家检定机构及药品审评中心商定所需进行的试验项目和方法，以及判定标准。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体
一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体
(一)杂交瘤细胞
1．亲本细胞
(1)骨髓瘤细胞
SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
(2)免疫亲代细胞
经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。
2．细胞融合与克隆化
采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。
3．杂交瘤细胞检定
(1)抗体分泌稳定性
连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。
(2)细胞核学特征
检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。
4．鼠源病毒检查
按附录要求检测鼠源病毒。
5．支原体检查
按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
6．无菌试验
按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
(二)单克隆抗体的检定
1．免疫球蛋白类及亚类
用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。
2．亲和力
用可靠、准确的方法测定单克隆抗体(以下简称为单抗)的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。
3．特异性
测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。
4．交叉反应
按附录要求。
免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
5．效价测定
用适宜方法测定。
(三)其他原材料
1．细胞培养用小牛血清
支原体检测应为阴性。经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
2．培养液
应有培养液来源，质量指标。
3．化学试剂
规格应达到分析纯以上。
二、基因工程抗体
参考《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和本指导原则中的有关要求进行。
三、细胞库的建立
应分别建立原始细胞库、主细胞库、工作细胞库的三级管理细胞库，一般情况下主细胞库来自原始细胞库、工作细胞库来自主细胞库。各级细胞库应有详细的制备过程、检定情况及管理规定等。
四、单抗生产
包括用小鼠腹水法和细胞培养法制备。
(一)小鼠腹水法
1．小鼠
制备腹水必需使用合格的SPF级BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠杂交子一代。
2．动物实验设施
动物实验设施应有相关部门颁发的二级以上合格证。
3．腹水制备
取适量扩增培养的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔制备腹水，小鼠可以预先用液体石蜡或降植烷等处理。
(二)细胞培养法
可以采用发酵罐培养，亦可用细胞培养瓶培养收集上清液制备单克隆抗体。培养基用无牛血清或低牛血清培养基，不能用-内酰胺类抗生素。
(三)抗体纯化
可采用盐析法、分子筛层析、离子交换亲和层析等适宜的方法。
1．尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。
2．应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其它热原质、培养液成分或层析柱析出成分等。
3．应验证所用的纯化方法能有效的去除/灭活病毒。
4．连续产生的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
5．纯化后处理
必要时对纯化后抗体采用适宜方法进行处理。
(四)半成品、成品制备
五、检定
包括原液(小鼠腹水、细胞培养上清液、纯化抗体)、半成品及成品的检定等。
(一)物理化学检测
1．外观
液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体，不应含有异物、浑浊或摇不散的沉淀。
2．pH值
电位法测定
3．蛋白质含量的测定
用Lowry法或其它适宜的方法测定。
4．纯度测定
(1)电泳法
用还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。扫描后免疫球蛋白含量应达到95%以上，二聚体≤10%。
(2)HPLC法
纯度应≥95%。
(3)多聚体测定
用FPLC或HPLC法，用适宜的分子筛层析，多聚体应≤10%。
5．DNA含量测定
用DNA分子杂交法。每一剂量残余鼠骨髓DNA含量不高于100pg。
6．水分
产品如为冻干制品，应进行残余水分测定，其含量应≤3%。
(二)生物学检定
1．活性及效价测定
用适宜方法进行。
2．鼠源病毒检定
同上鼠源病毒检查。
3．无菌试验
同上无菌试验。
4．支原体检定
同上支原体检定。
5．安全试验
用小白鼠和豚鼠进行试验。
6．热原质试验
按照现行版《中国药典》生物制品热原质试验规程进行。采用家兔法时，家兔注射剂量=(人用剂量/50)*20*家兔体重(kg)。也可用鲎试剂法，1mg/mL蛋白浓度不应检测出有凝集活性。
7．异常毒性实验
(三)非免疫球蛋白杂质分析
包括来源于细胞基质、培养基和下游工艺的相关杂质，采用适当的技术和方法进行分析检测。
六、经修饰的单克隆抗体
为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其它物质偶连形成免疫结合物，或在同一段多胎链包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得。研究者除对前面提到的有关未偶连单克隆抗体(未修饰单克隆抗体)的要求外，还应提供下列内容：
(一)免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括：
1．描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子，包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征。
2．制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螯合剂。这些资料应该包括试剂来源、制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物中所用化学试剂毒性相关资料。
3．在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系。
4．用重组DNA技术制备的制品(如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形的，互补决定区[CDR]接合的及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物)应提供构建和置备过程的全部资料。重组免疫结合物的稳定性应认真研究。因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性(如通过重组Fvs形成“双抗”)可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合。
(二)免疫结合物的纯度
1．应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应。
2．应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量。活性中间体应被灭活或去除。
(三)免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定性
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
1．应采用适当的方法；评估偶联前后的免疫反应性。
2．免疫结合物非免疫球蛋白成分的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估(例如，毒素、细胞因子或酶等)，用于造影的放射性免疫结合物除外。
3．免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
4．应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性。假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来代替血清。经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品的稳定性的条件及所用阴、阳对照。
(四)与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。
1．放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质。放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行。
2．制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信涵。
3．在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
4．应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
5．适当的时候，应检测免疫结合物形成胶体的情况，并对其进行限定。
6．有关单抗制备中放射性标记物的质控标准参考国家关于放射性药品规定。
七、产品稳定性
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能代替实际的稳定性资料。
(一)应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验(如断裂或聚合)，效力试验，无菌试验，以及水分、pH和防腐剂的稳定性测定。
(二)确保制品生物活性的稳定性试验(例如定量体外效率试验)应包括厂内参比品。如可能在试验的全过程中只使用一批试验抗原(如：纯化的抗原、细胞或组织)。应用定量效力试验使对生物活性进行有意义的比较成为可能。
(三)加速稳定性试验，既将制品储存在温度高于常规储存温度后的稳定性试验，可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验。表示稳定性的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测。
八、临床前研究
由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化。因此，建议在临床前研究中所使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致。
(一)交叉反应性试验
当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时，可观察到抗体与它们结合。非靶组织结合可能具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在Ⅰ期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐个评估。
1．检测交叉反应性的体外试验
目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认的新技术(参照1．2．4)。
2．测定交叉反应性的体内试验
当有适当模型时，单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验。试验结果，特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体，通常要求进行更广泛的临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验。设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位。
(二)临床前药理学和毒性试验
1．设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中可能的毒性
评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度，并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量。有关单克隆抗体的临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能。
2．动物毒理学研究
当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下：
(1)若被试样品为未偶联抗体，且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须的。
(2)动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。但是，对于所用的动物模型，不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补。应鉴定动物和人之间存在的抗原数，单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异。这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全范围。
(3)对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估。
(4)拟给育龄妇女反复或长期使用的产品，应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验。
3．药效学和动物药代动力学
(1)当有动物模型时，则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的范围，可以更好地预测治疗指数；当无适合动物模型时，则应尽可能以人外周血、组织器官等进行体外药效学研究。当有动物模型时，药代动力学的有关资料(生物学分布，半衰期等)可以从动物模型中得到；当无适合动物模型时，动物药代动力学可以考虑不做，加强临床试验时药代动力学方面的监控。
(2)下列方面可以指导药代动力学几药效学试验动物种类的选择：
①最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验。对于仅抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原(细菌，病毒等)的未偶联单克隆抗体，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验。
②当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。
③应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。
(3)鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠内所得的重复剂量结果难以推至拟在人体内使用的重复剂量。使用完全人源的、嵌合的或“人源化的”单克隆抗体将出现相应的问题，在这种情况下用啮齿类动物进行重复剂量的研究意义不大。
4．用免疫结合物进行的临床体内研究
(1)应在体内试验免疫结合物的稳定性
①应测定免疫结合物中每个组分在动物体内药代动力学和组织分布，并且与未偶联抗体的分布相比较。
②不同组分的靶组织和他们能引起的潜在的毒性应被证实。
(2)由于免疫结合物可能被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合的结果，应对含有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性实验，尽管该种动物不存在靶抗原。根据免疫结合物组分的性质和其偶联的稳定性，对组分分别进行试验是有道理的。应充分描述每个组分的毒性情况、副反应的发生和严重程度。所得结果应与结合物稳定性试验密切相关。如可能，应用具有相关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验，如果不存在靶抗原阳性动物就在啮齿类动物体内进行。游离毒素或核素的毒性试验可在不同类动物中进行。
(3)对于放射性核素的免疫结合物：
①动物生物分布的资料可被用于对初始人用剂量的评估。
②如可能，表达靶抗原的动物模型更有可能发现抗原“减少”或带有在生物分布和/或毒性方面表现意外抗原的组织。
③异源移植模型可以组织定位和抗原非特异放射性免疫结合物分布问题，但对确定一般组织交叉反应范围没有帮助。
④应研究适宜的动物数量以用一个可接受的变异系数(通常小于20%)对放射性剂量进行评估。
⑤对于使用放射性总量的新陈代谢和测定从早到晚清除期时间点的适当数值应有完整计算。
⑥放射性免疫结合物应通过在血清或血浆中孵育检测体外稳定性。应建立方法来评估游离表位，偶联单克隆抗体，标记的非单克隆抗体三种中每成分存在的放射性百分比。
说明：对局部外用和制备体外诊断试剂盒单克隆抗体要求参照上述相关部分执行，但其生产条件、小鼠清洁级别、抗体纯度和安全试验可根据实际需要降低或减少要求。
附录： 鼠源性病毒检测
1．被检病毒
人用鼠源性单抗制品中可能含有潜在污染的病毒见下表。
───────────────────────────────────────
组 病毒 受影响动物
───────────────────────────────────────
Ⅱ 出血热病毒 大鼠，小鼠
淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒(LCMV) 大鼠
3型呼肠孤病毒(REO) 大鼠，小鼠
大鼠轮状病毒 大鼠
仙台病毒 大鼠，小鼠
Ⅱ 脱脚病病毒 小鼠
KITHAM氏大鼠病毒(KRV) 大鼠
小鼠腺病毒(MAV) 小鼠
小鼠肺炎病毒(PVM) 小鼠
逆转录病毒 大鼠，小鼠
TOOLAN病毒(HI) 大鼠
───────────────────────────────────────
前五种病毒属Ⅰ组，为能够感染人与灵长类动物的病毒，后六种属Ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人，但对人类具有潜在危险性，能在体外培养的人和猿、猴源性细胞中进行复制，这些病毒应作为重点进行检测。
2．样品
包括细胞株、腹水、动物血清、单抗半成品和成品等，用适宜方法预处理。
3．试验方法
包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等。
3．1 细胞实验
细胞及培养上清液分别接种人2BS、Vero细胞，培养，传两代后制片，用间接免疫荧光法检测病毒抗原。
3．2 动物抗体产生试验
样品接种出生24小时以内乳鼠10只(i．m)；15-20g成年小鼠20只(i．mti．p：10只接种样品，10只作为对照)；小鼠20只(i．c：10只接种样品，10只作为对照)。观察4周存活率应在80%以上，用ELISA或其他适宜的方法检测血清中病毒抗体。
3．3 鸡胚感染试验
应用鸡胚接种进行检查，可用9～11天龄的鸡胚，将样品注射于10个鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊腔及卵黄囊中。接种后鸡胚至少在5天后才能进行检查。并用豚鼠、鸡或其它禽类的红细胞检查尿囊液中是否含有血凝素。
4．检测范围?
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样品 细胞实验 动物抗体产生试验 鸡胚感染试验 备注
原始细胞库 + - + 每批检查
主细胞库 + - + 每批检查
工作细胞库 + - + 每批检查
鼠群 - + - 定期抽查
腹水 - + - + 每批检查
细胞培养法制备 每批检查
单抗的上清液
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人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则
一、引言
基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。
基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为体外基因导入(exvivo)及体内基因导入(invivo)两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复(混)合物。基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前，一些基因治疗研究相对比较成熟，而一些则不够完善，更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此，研究者应加强咨询和论证，提出一个科学可行的研究方案，最终获得确保安全有效的基因治疗制品。
在向国家药品监督管理局申报临床试验时，除须按本指导原则中“研究内容和制品质量控制”准备材料外，同时需提供下述材料：
(1)国内外研究现状和进展(综述)。包括：
1．所用基因的研究现状和进展；
2．所用载体的研究现状和进展；
3．所用基因导入系统和方法的研究现状和进展；
4．该研究或制品相关的体外有效性实验资料；
5．该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料；
6．该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料；
7．该研究或制品的生产工艺现状；
8．该研究或制品的质量控制现状；
9．本研究或制品的先进性和创新点；
10．本研究或制品产业化的可行性。综述内容须科学客观。
(二)本研究或制品的知识产权情况。包括：1)本研究或制品的知识产权情况阐述；2)本研究或制品的知识产权检索报告和检索结果。知识产权情况的阐述和检索应包括所用基因、载体、重组体、终产品的其它成分、生产用细胞和生产工艺等。
二、研究内容和制品质量控制
(一)DNA重组体或基因导入系统的构建
1．治疗用的目的基因
详细说明基因治疗所用的目的基因及其来源(尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料)，获得目的基因的材料方法和基因鉴定结果。
2．载体
包括载体DNA的限制性内切酶图谱或基因库资料。若有特殊的元件，如启动子、增强子及PolyA位点等，应提供详细资料。若有改变结构(如丢失片段，点突变或插入片段)，须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。
非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽、金属颗粒等。本指导原则不包括寡聚核苷酸(如Antisense RNA，Ribozyme，RNAi等)类基因治疗制品。
3．DNA重组体
详细说明克隆步骤，材料方法；DNA序列分析图谱和结果，注明启动子、增强子、插入顺序、目的基因及polyA顺序等；重组体的限制性酶切图谱和鉴定结果；重组体中基因表达水平和时程。
4．基因导入系统构建包括病毒载体与非病毒载体基因导入系统。
(1)病毒载体基因导入系统包括腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体基因导入系统等。需详细描述形成单克隆原始病毒颗粒的方法、材料、技术路线和全部的鉴定方法、标准和结果。这些鉴定一般包括：结构鉴定(限制性酶切图谱和PCR分析)、整个病毒的序列分析(≤40kb)，基因体外表达和生物活性，SDS-PAGE、表达盒DNA序列分析、Westernblot分析、转染效率、透射电镜负染法观察、复制型病毒的检测和其它污染因子的检测。
(2)非病毒基因导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体物质，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。由于部分病人对青霉素的过敏反应，最好不用耐氨苄青霉素基因作耐药基因，而建议用卡那霉素或新霉素基因作耐药基因。若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达的生物活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。每一操作步骤必须鉴定其结果，通常的鉴定内容和方法有：限制性酶切图谱，基因的PCR扩增，表达盒DNA序列分析，SDS-PAGE，Westernblot分析等。
(二)细胞库及工程菌库的建立和检定
包括包装和繁殖重组病毒的细胞库和扩增重组质粒的工程菌库。必须建立三级库，即原始细胞库(Primary Seed Bank)、种子细胞库(Master CellBank)和工作细胞库(Working Cellbank)；或原始工程菌库、种子工程菌库和工作工程菌库。
1．细胞库
(1)原始细胞库
需说明来源、代数、细胞特性及有关档案资料。对主细胞库和工作细胞库需详细说明建库过程，包括材料、方法、步骤、细胞库存的数量和登记档案等。
(2)主细胞库
主细胞库由原始细胞库直接传代建立或通过亚克隆方法筛选后建立。应明确使用代次。
(3)工作细胞库
工作细胞库由主细胞库传代建立。应明确工作细胞库的使用代次。
(4)细胞库检定
①主细胞库或工作细胞库检定应依据《生物制品生产用细胞的制备及检定规程》的要求进行。
②病毒转导效率和病毒的产量等的检定
③导入基因的存在状态，稳定性及其表达水平的检测
④复制型病毒的检测
若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤和传代次数等。
2．工程菌库
工程菌主种子库和工作种子库的建立和检测应按现行《中国药典》相关要求建立。
(1)工程菌主种子库的检定
①菌种同一性鉴定：菌种/株的来源、基因型及表型。基因型通
过RAPD方法鉴定，通过测定重组质粒的特殊标记和抗药性标记确定表型。
②菌种培养纯度检定：外源因子(如杂菌、真菌、噬菌体等)的检测。
③菌种稳定性检定：转化菌的比例，扩增条件、质粒拷贝数，基因表达量、允许的传代次数。
④基因表达盒序列分析：插入的目的片段以及调控序列进行测序分析。
(2)工程菌工作种子库的检定
除外基因表达盒序列分析，其它检定内容按上述工程菌主种子细胞库的检定。
(三)基因治疗制品制备和生产工艺
1．一般要求
(1)制备和生产条件及环境说明。强调基因治疗制品的制备和生产须按GMP要求进行，特别是对exvivo方式的细胞制品和重组病毒制品。临床前研究和临床研究用的重组病毒制品应该在经验证的(validatable)生产工艺途径下制备。
(2)详细的制备和生产工艺方法、材料和技术路线。
(3)制备和生产过程控制。在生产过程中，一些步骤必须进行监测，并要求有监测记录。
(4)一批制品生产的原始制造及检定记录。
(5)中国药品生物制品检定所或由国家药品监督管理局指定的单位对一批制品的检定报告。
2．以重组病毒作为基因治疗制品者，要求必须建立种子病毒库和工作病毒库。工作病毒库直接从种子病毒库病毒接种细胞传代制备。需详细描述病毒库的来源、建立、克隆性，传代和保存条件和方法。其质量控制方法和标准见本指导原则有关部分。须从工作细胞库细胞复苏，传代成生产细胞开始工艺过程，不得用非细胞库来源的细胞直接进行生产。做重组病毒制品时，须使用工作病毒库的病毒去感染生产细胞，不得用非病毒库来源的病毒直接进行生产。可以使用贴壁细胞或悬浮细胞大规模培养技术。病毒库可以不经过纯化而直接从细胞裂解液来制备。制剂配方也十分重要，不合适的制剂配方会影响制品活性和保存期限。
3．非病毒型重组质粒DNA复(混)合物作为最终制品者，要求需详述。
(1)重组质粒DNA的生产制备和质控
(2)脂质体的来源和性质，或者制备方法
(3)多肽的来源和性质，或者合成方法
(4)其它成分的来源和性质，或者制备方法
(5)重组质粒DNA复(混)合物终制品的生产制备和质控
通过基因枪等物理和化学方法将基因导入人体者，需说明目的基因的制备、表达、裸DNA大量扩增、分离、纯化，仪器设备的性能和详细的导入方法。
4．以基因工程化的细胞为最终制品者，包括exvivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。详细说明细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、细胞的exvivo转染方法及筛选。洗涤最终制品中所用的保存液配方。
(四)制品的质量控制
根据基因治疗类制品的生产工艺特点，其质量控制的原则主要是：检定项目尽可能在成品中进行；如成品中的添加成份影响检定结果，则需在原液中进行。
1．重组病毒作为基因治疗制品的质量控制
根据目前国内外的进展和完善程度，这里以重组腺病毒(rAd)制品制品来描述重组病毒基因治疗制品的质量控制，其它的重组病毒制品可参考这些质控要点。
(1)重组腺病毒(rAd)作为基因治疗制品的质量控制
①原液检定：
a．无菌试验
按2000年版《中国生物制品规程》附录《生物制品无菌试验规程》进行。
b．病毒颗粒数测定
c．具有感染能力病毒颗粒的测定(病毒活性)
②半成品检定
a．无菌试验
b．病毒颗粒数测定
c．内毒素测定
③成品检定
a．物理检查
b．外观
c．装量
d．化学检定：pH值
e．鉴别试验
限制性酶切图谱鉴别
插入基因检测
f．纯度：可采用A260nm/A280nm值法或HPLC法
g．病毒滴度测定
病毒颗粒数测定，采用A260紫外吸收法测定。?
具有感染能力病毒颗粒的测定，采用TCID50法。
病毒比滴度(比活性IU)，病毒感染滴度/病毒颗粒数(IU／VP)应高于3．3％。
h．效力试验
插入基因表达活性测定
插入基因的生物学活性测定
i．复制型病毒(RCA)检测
A549细胞检测法，每3．0×1010VP中应不高于1RCA(即≤1RCA/3．0×1010VP)
j．腺相关病毒的检测
采用PCR法，应无腺相关病毒(AAV)的污染。
k．残留量测定
应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测。
l．无菌试验
m．异常毒性试验
n．内毒素检测
重组病毒制品的稳定性试验：需对保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察。应进行不同温度及反复冻融对活性影响的研究。
(2)以exvivo形式用逆转录病毒转化的细胞(同体或异体)制品的质量控制
该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库，生产后细胞及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5％。生产病毒后细胞取样量须达每批中1％或108细胞(取少的)。检测方法应包括至少5代的细胞共培养扩增(如用Musdunni细胞)，随后须用PG4S+/L-法、标记挽救法或RT／PCR中的两种方法来检测。必须用阳性对照(COS4070A上清液)及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。
若为释放病毒的细胞，须测定：
①细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。
②活细胞比例和细胞浓度。
③目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因“插入性突变”及其观察方法及结果。
④细胞冻融后的质控
冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。
冻融后细胞上清液中的下列检测结果：
a．无菌试验
b．热原质实验
c．冻融后细胞的异常毒性试验。
d．病毒转导基因活性。
e．支原体检查。
若为逆转录病毒上清液，须测定：
①病毒滴度
②病毒结构检定
③病毒转导基因的活性
④复制型病毒(RCR)的检测。由于逆转录病毒或RCR具有
整合入人细胞染色体的特性，有遗传性毒性，因此对制品中RCR的检测要严格进行和严格要求。
⑤上清液中的细菌、热原质及其它外源因子等。
⑥上清液中牛血清蛋白残留量。
鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间(如支原体)，这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。
2．非病毒型重组DNA基因治疗制品
(1)纯度：超螺旋型的含量，细菌基因组DNA、RNA和蛋白残留量。
(2)DNA结构检测
(3)脂质体、多肽或金属粒子等的来源和性质。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。
(4)无菌试验
(5)热原质试验
(6)过敏试验
(7)异常毒性试验
(8)介导目的基因的活性检测
(9)有害物质残余量的测定
(五)基因治疗的有效性试验
有效性试验包括：
1．体外试验
须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。
2．体内试验
提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。证明在非靶组织器官中基因表达的分布。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径(如动脉插管)有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。
若有些方案在动物中难以观察其疗效(如种族差异)，应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。
(六)基因治疗的安全试验
对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：
1．总体安全性评估
除了在质控中已规定的各项要求外，对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导人体，应提供以下资料：
(1)生长因子的依赖性细胞，对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性，不能再予以使用。
(2)对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
(3)对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。
(4)致癌试验。无论是自体或异体细胞，经基因操作后，均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品，必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致癌试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致癌试验。
(5)细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品，应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞(如淋巴细胞)，则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性(包括致癌试验在内)的依据。
(6)复制型病毒的检测，若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒。
(7)添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，某些exvivo或invivo导入基因或细胞时，需要加用其它添加物，对此类物质必须有动物实验证明其安全性。
2．分子遗传学的评估
对invivo的治疗方案，必须提供动物体内重组病毒或重组DNA制品导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的表达情况。对于exvivo的方案。须提供导入基因的细胞进入体内后的活性和目的基因的表达情况和分布。
3．毒性反应的评估
这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性(最大耐受量)及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量(按体重或表面积计算)外，尚需有一个较大的剂量范围。剂量范围应包括大于临床使用剂量以确定最大耐受量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。
对于exvivo方案，对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入，一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物(如明胶、缝线、特殊的导管等)，以及对于某些重要人体脏器内导入(如心、脑、肝等)，必须作动物体内毒性作用的试验，并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子，亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案，无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。
4．免疫学的评估
无论病毒型与非病毒型载体系统，均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应(如对裸DNA)等，并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。
对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统(如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞)，更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料(参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》)。
5．致癌试验：见本指导原则相关部分。
(七)基因治疗临床试验方案
基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用，首先是它的复杂性，例如对于exvivo方式，需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织，甚至通过手术进行操作；二是它的风险性，尚存在许多未知的因素，须对临床研究的全过程进行严密监控，并在申请临床研究时须提供下列资料：
1．提供申报单位符合GMP生产条件的证明。
2．提供临床研究单位和直接参与研究人员的名单和简历。
3．明确给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂，须提供详细的操作过程。
4．一般临床指标和实验室检测。
5．病人及家属的同意书
6．靶组织和非靶组织的分子生物学检测。
靶组织和非靶组织的分子免疫学检测。若导入重组病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。
7．可能产生的副作用或不良反应的记录，建立实施治疗方案中的事故报告制度。
8．随访的计划及实施办法。
(八)伦理学考虑
必须充分重视伦理学的原则，并具体按国家药品监督管理局GCP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前，须向病人说明该治疗方案属试验阶段，它可能的有效性及可能发生的风险，同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗，以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人及家属充分理解并签字后才能开始治疗。
人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则
一、序言
体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种(非人体)的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核白细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞(IVS)等等；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞(瘤苗)；体内植入经体外操作过的细胞群如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等等。
由于体细胞治疗的最终制品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性、复杂性和特殊性，因此不能象一般生物制品那样制订出适合于每一种方案的具体标准，本指导原则只提出一个共同的原则，具体的申报资料和应用方案应根据本技术指导原则加以准备、申请和实施。对每个方案的整个操作过程和最终制品必须制定并严格执行(实施)标准操作程序，以确保体细胞治疗的安全、有效。
二、申报资料
(一)体细胞治疗制剂的名称、选题目的与依据、国内外研究现状或生产使用情况
1．申请表
2．体细胞治疗制剂的名称及命名依据
3．选题的目的和立题依据
4．国内外有关该制剂的研究现状、生产及临床应用情况(包括专利查询情况)
5．临床应用的风险性评估
(二)体细胞的采集、分离和检定
1．体细胞类型和供体的情况
(1)体细胞类型
须指出细胞来源是属于自体、同种异体、异种还是细胞系。必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态生化或表面标志等。
(2)供体
若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。对于那些需通过激活体内免疫功能发挥作用或需体细胞在体内长期存活的体细胞治疗项目，除ABO血型外，还必须对供体做HLA-I类和II类分型检查，并证明与受体(病人)相匹配，同时提供检测方法和依据。
若体细胞来源于动物，必须提供动物的来源，遗传背景，健康证明(如重要病原体，包括人畜共患疾病的病原体)，饲养条件，应用此类体细胞的必要性和安全性。
(3)细胞系
若采用细胞系进行体细胞治疗，应按国家相关规定进行主细胞库、种子细胞库及生产细胞库三级细胞库的建立及管理。应详细记述细胞的来源、鉴别标志、保存、预计使用寿命，在保存和复苏条件下稳定性的依据。生产细胞库不应含有可能的致癌因子，不应含有感染性外源因子，如细菌、霉菌、支原体及病毒。
2．体细胞的采集
应对采集体细胞的技术方法的安全性、可行性、稳定性进行充分论证，应提供体细胞采集技术的标准操作程序，应说明采集体细胞的地址/环境，所用的设备和设施、保存和运输的环节和条件，预防微生物及病毒等有害因子污染的方法，预防共用设备和设施可能带来的交叉污染等措施。
3．体细胞的分离
应详细规定分离体细胞用的方法、材料及设备，应提供在此过程中所用的各种材料的资料，如果是购买的原材料，应有供应商/制造商提供的产品说明及分析合格证明。
当应用单克隆抗体进行有关操作时，应参照国家药品管理当局有关规定进行。
4．体细胞的检定
在体细胞采集及分离过程中的适当阶段，应对体细胞进行质控检定，包括采集与分离体细胞的收率、存活率、纯度、均一性等。应详细说明检定体细胞所用的方法、材料及设备，并制定合格标准。
(三)体细胞的体外操作
1．培养基
(1)所有成分应有足够纯度(例如水应符合注射用水标准)，残留的培养基或受者不应有明显影响。每个培养细胞的部门应保证所用的各种成分的质量都经过鉴定，并制定标准规格。若用商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成分资料。
(2)血清的使用
除能证明体细胞培养或激活需要血清外，应避免使用任何血清。不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应考虑每批血清都应对潜在的外源因子(包括人的病原体)进行检查、筛选。例如，牛血清应进行病毒和支原体污染的检查筛选等。
(3)人血液成份的应用
若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白及转铁蛋白，应说明其来源、批号、质量检定合格报告，应尽可能用已批准上市的产品。
(4)条件培养基的应用
在体细胞培养中使用细胞培养来源的条件培养基时，有可能增加了制剂的危险性及降低产品的一致性。因此，尽可能确定条件培养基的必要成份，以及尝试用确定的试剂取代条件培养基。在应用条件培养基时应考虑以下几点：
①应详细提供条件培养基的来源、加工及使用说明。
②当用供者(人)细胞制备条件培养基时，应对供者按献血员标准进行传染因子的检查。
③当用自体细胞制备条件培养基时，应减少传播病毒性疾病的危险，病毒在体外扩增的能力亦应考虑。
(5)抗生素的应用
培养基中尽量避免使用内酰胺类抗生素。若采用青霉素类抗生素，应做青霉素皮试，该细胞制剂应标明加用的抗生素，并不得用于已知对该药过敏的患者。另外，应做不加抗生素的培养对照，以证明能够保持无菌。
(6)其他成份
应充分说明体细胞培养和激活时所采用的有丝分裂原、抗体、细胞因子、化学物质，以及培养物。应尽可能采用国家批准临床应用的产品。如上述成份的生产厂家已获国家批准临床应用，可以引用该批件。如上述成份的生产厂家未获国家批准临床应用，应参照国家对相应产品的质控要点，提供质量标准，并对每批产品提供详尽的质量检定报告。
(7)培养基的检定
对每批制成的培养基(例如已加入血清及生长添加物等)应进行无菌试验，以及对拟给病人用的体外培养细胞的激活及/或支持生长试验。
2．生产过程
生产部门对制备工艺流程应有详细的标准操作程序和适时修订的程序。收获时应保留细胞及培养基样品，供检定用。若细胞培养技术有改进，则应评估对细胞得率、生物学效应、均一性及纯度的影响。
应叙述保证细胞批同一性和防止交叉污染的质量控制系统，以及适用于长期培养时定期进行的和在体外培养后输注前对所有培养物进行的质量控制系统。
3．质量控制
应对所有成份分离、培养及最后处理细胞所用的器具进行质量控制。各种成份都应进行同一性及污染物检查。有生物活性的成份还应进行功能检定。批记录应予保存，该记录应反映制备每批体细胞的所有步骤，记载每一成份的批号及所有检定结果。
(四)体细胞制剂的检定与质量控制
各批体细胞的检定包括为验证操作过程对最初数批体细胞所进行的检定及在操作过程做任何改变后进行的检定，以及确定安全性和生物学效应等对每批体细胞所进行的检定，应依据实施方案制定合格标准。
1．每批体细胞的检定
(1)得率及存活率：于回输前应进行体细胞得率及存活率检定。
(2)每批细胞来源的确认：应注明供者的来源并加以标记或确定批号。
(3)无菌试验：每批培养的体细胞在患者输注前均应进行无菌试验。建议在培养开始后3～4天起每间隔一定时间取培养液样品，包括患者回输前24小时取样，按现行版《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。在患者使用前，取培养液及/或沉淀物用丫啶橙染色或革兰染色，追加一次污染检测。
进行长期培养的体细胞，应进行支原体检查。对大多数自体体细胞产品而言，有效期很短，因此有些试验(如支原体检测)可能对制品的应用来说耗时太长，但每批制品的留样检测是必需的，其结果可以为制品的质量控制提供完整资料。虽然单个病人应用的体细胞不会等到检测完成后再回输，但是如果留样发现阳性结果或发现几次阳性结果后，应及时对生产过程进行检查。如果在体细胞制备的早期发现有污染的情况，应终止该批体细胞制品的继续制备。如果某些检测结果在制品应用时还无结果，应说明可获得结果的时间。
(4)体细胞的纯度与均一性
在体细胞回输前，应证明其纯度和均一性已达到可应用水平。
对于经过数代培养的体细胞应进行细胞的鉴定及无污染检查，以保证未被其他类型细胞污染或取代。
对于体细胞体外操作中所用的非人用成份应测定其成品中的含量，并制定相应的限量指标。
(5)生物学效应
如有可能，应尽量检测每批体细胞的生物学效应，例如体细胞具有的某种生物学功能，分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。
2．体细胞制剂的检定(申报临床前完成)
检定项目：
(1)体细胞制品的得率和存活率：
(2)体细胞制品的纯度和均一性或特征性表面标志：
(3)体细胞制品的生物学效应；
(4)体细胞制品外源因子的检测包括：
·细菌
·真菌
·支原体
·病毒
·内毒素
(5)体细胞制品其他添加成份残余量的检测(如牛血清蛋白、抗体、血清、抗生素、固相微粒等)。
3．体细胞制剂的制造及检定过程，及原始记录和中国药品生物制品检定所的复核检定报告。
4．体细胞制剂的稳定性
根据稳定性的实验结果确定有效期，说明体细胞制剂的保存条件、保存液的成份与配方。如果体细胞在处理之前、处理当中或处理之后需由一地运到另一地，应说明运输条件对保存体细胞存活率和功能的影响，应确保运输过程中体细胞制品达至上述检定标准。应提供运输容器能适用运输材料的合格证明。若体细胞制品经冻存后继续用于病人。应在冻融或再扩增后进行上述检定，达到检定标准。
(五)体细胞治疗的临床前试验
1．安全性评价
(1)生长因子依赖性细胞，对其生长行为必须予以监测，若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖，不能再予以使用。
(2)对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
(3)对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及安全性的依据。
(4)毒性试验
尽可能模拟临床回输方式，高于临床用量的相同组织类型的动物体细胞制品回输入动物体内，观察其毒性反应、过敏反应、局部刺激反应。对特殊来源的体细胞，按具体情况制定毒性反应的评价方法。
(5)致癌试验
对于某些长期培养的体细胞，应进行致癌性试验。
①体外试验：软琼脂克隆形成试验
②体内试验：采用裸鼠试验，按国家药品管理当局有关细胞株检定和质量控制要求进行，应证明经体外处理后已失去生长和增殖能力。
(6)对于体细胞终制品所用的附加物，应视为体细胞制品的一部分，应做动物毒性试验。
2．有效性评价
(1)体细胞的表型
应提供该类体细胞的形态学、表面标志等，该体细胞应具有预期的功能如分泌某种产物(或因子)，可通过体外试验加以检测。
(2)体外试验
检测体细胞制品的生物学效应如细胞毒效应、免疫诱导/增强或抑制效应、造血细胞增殖能力等。
(3)体内试验
如果有可能以动物模型来进行，临床前试验应测定体细胞制品在体内生物学功能及其治疗效果。
若某种体细胞治疗方法，因种属特异性等原因无法用动物模型体内试验来证实其有效性，应做特别说明，并提供和引证有效性的其它依据。
(六)体细胞治疗临床试验方案
1．临床试验方案除参照国家有关临床研究的规定外，必须包括所选用的病种、病人的年龄范围、性别、疾病的发展阶段(临床分期)、试用的病例数、事前制定病例选择与淘汰的标准。
2．给药的方式、剂量、时间及疗程。如果通过特殊的手术条件导入治疗制品，必须提供详细的操作过程。
3．评估疗效的客观标准，包括临床指和实验室检测项目。
4．评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准、以及监控毒副作用必须的临床与实验室检测的项目。
(七)研制及试用单位及负责人资格认证
提供研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员(包括负责医师、护士和实验室操作人员)的工作简历及从事与实施该项体细胞治疗方案有关的经验。提供研究单位从事符合GMP生产临床制品的条件和证明以及临床单位实施该方案的医疗条件。
(八)体细胞治疗伦理学考虑
详细要求参见国家药品监督管理局颁发的GCP有关规定。
变态反应原(变应原)制品质量控制技术指导原则
一、定义
变态反应原(变应原)：是指能够引起人类变态反应(过敏反应)性疾病的物质。包括：粉尘、昆虫类、动物皮毛、植物及植物花草、食物等。
变态反应原制品：是指用于诊断或治疗人类变态反应性疾病的产品。
二、质量控制原则
(一)初始原材料的控制
1．原材料
应详细说明变应原的原材料，包括其特殊的收集方式、预处理及保存方法，提供其质控标准(如外购，可由供应商提供)。原材料的质量和组成应尽可能一致。质控标准应包括对原材料的鉴别和纯度分析等。确定一种适宜的保存条件，以保证原材料在运输和保存过程中质量不变。常见变应原的原材料的技术要求如下，其他原材料参照执行。
(1)花粉类
花粉类变应原应在最佳的生态环境下收集。说明花粉的收集方式，并检测其异种花粉、孢子、同种植物的其它无关成分。以上检测结果应满足质控标准的要求。花粉收集应在植物学专业人员指导下进行。
采用显微颗粒记数的方法，其它无关花粉的含量应限制在2%以下，能检测到的孢子不能超过1%。花粉外的其它杂质的显微颗粒不得超过10%。特殊情况，应予以说明。
(2)真菌类
说明真菌的株或系，详细说明培养基的组成及培养方法，优先选择人工合成且不含致敏原的培养基。说明分离得到的原材料中真菌的形态特征(菌丝体和孢子体/只有孢子体/只有菌丝体)及培养基质。提供相关资料证明其培养方法不会促进真菌毒素(如aflatoxins和/或ochratoxins)的产生。真菌的培养应在真菌学专业人员的指导下进行。
应选择高抗原性、低毒性和无致突变作用的原材料。
(3)螨类
应说明选用螨虫的种、属和饲养物的组成及培养方法。饲养物的抗原性应尽可能低。对来源于人或动物的饲养物应当进行处理，以确保对可能存在的传染性病原体进行灭活。螨虫的培养应在专业人员指导下进行。
(4)动物来源的变应原
应明确动物的品系，选择健康的动物。说明被处死动物的保存条件和动物变应原的收集方法，并应在专业人员的指导下进行收集。
动物毛发或皮屑的收集，必须采用既不损伤动物皮肤，又能获得大量上皮材料的方法。不能采用磨碎整张皮肤/毛皮的办法。如处死动物取皮，必须在几个小时内取好皮或者将动物于适当条件下保存，以确保不致因尸体腐败而影响上皮。
(5)食品类
应选择在良好生态环境下生长的新鲜食品，其农药残留应符合相关的食品标准。食品原料的加工应采用适宜工艺，以确保抗原性不被破坏。
2．辅料和相关材料
辅料的质量标准应符合对药品的一般性规定。
变应原制品中所含成分如缓冲液、稳定剂、防腐剂，制备过程所用试剂如脱脂剂、提取液，以及稀释液等，应符合对一般药品生产所用原辅材料的要求。不能使用对人有免疫原性或过敏性的物质。
(二)包装材料
所用包装材料应符合对药品包装材料的相关要求。
(三)生产工艺
应说明生产过程，用一个图表(流程图)逐步地简要说明过程的原理，并配有解释文字。应清楚说明生产过程的不同阶段，例如粉碎、提取、过滤、净化、透析、浓缩、分离、灭菌和冻干等。应说明纯化和分离的原理，而且应清楚并明显的看出过程的哪一步使用了特殊生化技术。详细说明在生产过程中对中间体和半成品的鉴定，以及如何进行生产过程中的质控。
(四)变应原组分分析
采用适宜的化学和免疫化学方法分析所有变应原成分，详细说明所采用的方法及其可靠性，并附上相关参考文献。
(五)质量标准研究
应建立有关产品的鉴别、纯度、生物活性和制剂等方面，用于质控的所有检测方法和标准。厂家应规定抽检率和对中间产物及成品分别采用的检测方法等。一般情况下，下列试验对控制产品质量是可以采用的。
1．总蛋白含量测定
用适宜的蛋白含量分析方法对总蛋白含量进行测定。如：蛋白氮测定(PNU)等。
2．蛋白组分的测定
采用聚丙稀酰胺凝胶电泳，等电聚焦等适宜的方法检测其蛋白组分。
3．主要致敏蛋白含量测定
应采用适宜的分析方法，对制品中稳定的抗原成分进行检测，并与内部参考品(IHR)进行比较。可采用的方法有：交叉免疫电泳、交叉放射免疫电泳或免疫印迹试验，或其它适宜方法。
4．变应原总生物活性测定
应制定对每批变应原制品的总生物活性要求。总生物活性测定方法应标准化。可选用体外的放射变应原吸附抑制实验(RAST抑制试验)、直接RAST试验，或体内皮肤点刺实验(按药品注册的相关规定申请临床研究)。需详细说明操作方法、试剂和抗血清标准等。还要对检测样品和参考品的平行性关系进行检测。
应以IHR为标准，对每批产品进行总生物活性测定，并以生物活性单位表示效价。如果已有国际标准品(IS)，则每批制品的总生物活性应以国际单位(IU)表示。如产品是由一种或几种明确的变应原组成，可选用其它相关的方法，对变应原活性进行测定，如放射免疫扩散法、定量免疫电泳法或其它定量检测技术等。以上检测，也应采用生物活性单位系统进行校正。要求所测得的抗原效价应在标示效价的50%-200%之间，方法学研究应证实效价测定的标准差小于等于20%。
(六)标准物质
变应原制剂的标准化要求建立一个有准确定义的、经全面鉴定且性质稳定的参照品。
1．内部参考品(IHR)
应制备具有代表性的变应原制剂作为IHR，并以之作为对其它各批变应原制剂(包括中间体和半成品)进行质控的参考品。其它常规生产的变应原制剂应以IHR为标准，进行变应原成分鉴别及效价测定。
需采用适当的方法对IHR进行鉴定，并确定其特异的生物活性(体内、体外生物活性)。可通过与数批初提取物进行比较，说明IHR中存在所有相关变应原。
应采用适当的保存方法，以确保IHR的稳定。建议将IHR分装冻干并于低温(-20℃)条件下存放。IHR的热稳定性研究可通过加速降解试验进行，即通过比较保存于高温条件下变应原与持续保存于-20℃下变应原的相对降解率进行分析。稳定性考察项目包括对变应原制剂总活性的分析及相关变应原含量的检测。
2．国际标准品(IS)
如果已有IS，需进行IHR与IS的比较研究(包括定性和定量分析)。应进行IS和IHR总活性测定的平行线分析，如结果成立(呈平行关系)，则可以用IS按国际单位校正IHR的效价。
IS的使用需参照国际免疫学会(IUIS)变应原标准化分会的建议。
(七)经修饰或其它处理的变应原制剂
如果变应原经过化学修饰、沉淀或吸附等处理后，制剂中的变应原成分已经不再可溶，不能按常规方法进行检测。在这种情况下，就应该对处理前的中间产品质量进行检测并制定相应标准。
(八)制检记录及复检报告
应提供连续三批变应原制品的制检记录，以及中国药品生物制品检定所的检定报告。
(九)稳定性
变应原制剂的稳定性研究应重点考察样品存放期间的活性变化(应明确可接受的活性下降幅度)，如需再配制(reconstitutedproducts)，需提供稀释后的稳定性，以及稀释液本身的相关技术资料。
三、临床前药理学和毒理学研究
(一)药效学研究
应在可能的前提下，尽量提供药效学的实验数据。
(二)毒理学研究
从毒理学角度评价变应原制剂的安全性，原则上与其它注射用药物的要求一致。毒理学资料应包括急性毒性试验(诊断和治疗用制剂)和亚急性毒性试验(治疗用制剂)研究。
由于变应原制剂可能引起的免疫性副作用难以与一般的毒理相区别，所以传统的毒理试验方法不一定是恰当和可行的。
四、临床研究
(一)变应原免疫治疗(脱敏治疗)的适应证只限于呼吸道过敏性疾病，如过敏性哮喘和过敏性鼻炎。
(二)确定疗效所需的临床试验应采用多中心、随机、对照的方法，病例数应不少于50对。
(三)临床研究时间可随试验目的和变应原制品性质的不同而不同，考虑到变应原免疫治疗(脱敏治疗)特点，治疗用制剂的临床试验疗程应足够长，以制剂说明书的推荐时间为准，一般应不少于3年。
(四)对于已制备供应多年(十年以上)，有的临床资料证明其制剂安全有效者，可免做临床研究，但应按规范要求，整理有关临床资料上报。
(五)在已证明安全有效的粗制品基础上改进工艺而生产的标准化过敏原，可适当缩短临床试验的时间和观察病例数，一般临床试验时间不少于半年，主要考察其安全性，病例数不少于30对。
(六)应重视不良反应，对可能发生的严重不良反应，应提供治疗原则。
(七)混合变应原制剂，应提供混合变应原的治疗价值和混合变应原比单价变应原的优越性。
细胞培养用牛血清生产和质量控制技术指导原则
《中国生物制品生产用主要原辅材料质控标准》已由国家药品监督管理局颁布实施，为规范细胞培养用牛血清的生产、质量控制，促进我国牛血清质量的提高，特制定本技术指导原则。
一、总则
由于牛血清为疫苗等有关生物制品生产中一种重要的原辅材料，某些用于疾病预防的疫苗中还含有一定量的残余牛血清，因此，牛血清的生产质量管理应参照国家现行《药品生产质量管理规范》执行。
二、牛血清的生产
(一)牛血清生产单位必须经工商登记注册、具有独立法人资格，必须具有与牛血清规模化生产相适应的生产车间、设备。
(二)生产负责人及生产者必须具有相适应的专业知识，并经培训考核合格方可上岗。
(三)应有相对稳定的牛源材料来源；并与相应的供牛单位签定有法律效应的协议；协议内容应包括详细的牛群免疫接种情况、流行病的监测内容。不得使用疫区或近期有传染病流行地区来源的牛材料(如口蹄疫、结核、布氏、疯牛病疫区等)。
(四)生产用水及其他材料应符合《中国药典》及《中国生物制品生产用主要原辅材料质控标准》或相应标准的要求。
(五)应具有稳定的批量生产工艺；工艺流程中至少应有一次0．1um的过滤。灌装工艺应在百级净化区进行。
(六)直接接触血清的器具应进行灭菌及去热原处理。
(七)应建立系统的生产质量管理体系，包括批生产记录及生产工艺的操作细则。
(八)不得混用非牛源血清材料用于生产；产品中不得添加防腐剂或抗生素等。
三、质量管理
(一)应具有牛血清质量控制相适应的实验室及仪器设备。
(二)生产单位应具有独立于生产的质量控制部门，负责包括牛源、初制原料、生产过程及终产品的质量控制。
(三)质控人员应具有相适应的专业知识，并经培训考核合格后方可上岗。
(四)建立完整的质量控制体系，按《中国生物制品生产用主要原辅材料质控标准》要求进行检测。
(五)企业应建立严格的审批合格签发制度。
四、企业管理
(一)应建立系统的生产、质检管理制度，岗位责任制度及标准操作细则。
(二)应建立完善的销售管理制度。
(三)应建立留样制度。
